在免疫印跡中防止高背景的小訣竅

   在免疫印跡實(shí)驗中遇到的質(zhì)控問(wèn)題之一最常見(jiàn)的就是高背景。當一個(gè)高的背景發(fā)生時(shí)，很難從不相關(guān)的數據中區分出相關(guān)的數據。一個(gè)常見(jiàn)的高背景可以由于很多原因導致同時(shí)需要一些工作來(lái)解決 -- 因為不解決這些問(wèn)題，這個(gè)印跡無(wú)法讀取.

保證緩沖液沒(méi)有被污染

   一個(gè)被污染的緩沖液在免疫印跡中很容易導致高的背景。大多數情況下，由于細菌的存在會(huì )導致被污染的緩沖液 -- 但是也有其他的污染物. 當污染物進(jìn)入到緩沖液中后，他們會(huì )影響整個(gè)印跡的整體, 包括背景. 解決這種干擾的辦法是將舊的緩沖液全部扔掉，重新配置新緩沖液。

確保操作步驟是*恰當的

   另外一個(gè)能夠導致高背景的原因是沒(méi)有進(jìn)行恰當的操作步驟。差的膜操作，膜過(guò)度曝光， 以及不足的漂洗都會(huì )導致高背景。這些問(wèn)題可以通過(guò)恰當操作來(lái)解決。當膜變干的時(shí)候膜的糟糕操作通常會(huì )發(fā)生。如果沒(méi)有使用正確的化學(xué)試劑恰當的潤濕膜會(huì )變干; 通常來(lái)說(shuō)是甲醇.

膜的過(guò)度曝光也是一個(gè)問(wèn)題 -- 但是它很容易解決. 你所要做的是將膜曝光的時(shí)間縮短. 同樣的，不充分的漂洗只是需要將沖洗更加充分*. 漂洗用來(lái)去掉過(guò)量的抗體. 當很多抗體存在印跡上時(shí)，很難將印跡和背景區分開(kāi)來(lái)。改進(jìn)的漂洗也可以通過(guò)使用更好的漂洗溶液來(lái)進(jìn)行。

去除不充分的封閉

    沒(méi)有正確的封閉, 免疫印跡的結果無(wú)法容易讀取. 不充分的封閉通常發(fā)生因為在孵育過(guò)程中的問(wèn)題. 如果孵育的時(shí)間不足夠長(cháng)，正確的區域不能得到封閉. 如果孵育的溫度不正確的話(huà),封閉也不能完成. 也有化學(xué)試劑可以加入到這個(gè)過(guò)程中來(lái)進(jìn)一步提高封閉. 

保證封閉劑的兼容性

   封閉劑, 如同在印跡實(shí)驗中使用的其他產(chǎn)品一樣，需要根據特定的應用進(jìn)行調整. 使用錯誤的封閉劑很容易導致干擾和很差的難區分的印跡. 一些封閉劑基于血清蛋白的，而其他的是基于蛋白的。不同的抗體可以和封閉劑有潛在反應，所以有必要找到最合適的封閉劑. 無(wú)蛋白的封閉劑是良好封閉劑之一也是最容易的溶液.

降低抗體的濃度

  通常高濃度的抗體會(huì )導致高的背景. 因為抗體濃度太高了，整個(gè)膜會(huì )被抗體所包被. 這會(huì )使得出決定性的結論很難. 當提到高濃度的抗體，只有很少一些解決方案可以解決?？贵w可進(jìn)行恰當漂洗或更低濃度的抗體可以被使用. 膜或許也需要恰當的處理 -- 只要沒(méi)有過(guò)度干掉 -- 它不會(huì )吸收很多的抗體溶液. 

高背景也會(huì )發(fā)生當使用的化學(xué)試劑和耗材不合適或質(zhì)量很差. 在免疫印跡中高背景是經(jīng)常顯著(zhù)發(fā)生的多種問(wèn)題之一。. 

其他需要考慮的因素之前已經(jīng)討論了就是轉印膜的選擇: PVDF膜或硝酸纖維素膜  - 哪種膜最好?.  一個(gè)經(jīng)常被忽視的問(wèn)題是膜的效期.  在使用膜之前, 確保它沒(méi)有過(guò)期同時(shí)被正確儲存。

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