流式細胞儀的調試和校準

　　流式細胞儀的調試和校準：

　　流式細胞儀在使用前，甚至在使用過(guò)程中都要精心進(jìn)行調試，以保證工作的可靠性和最佳性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區的光路等。

　　激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長(cháng)的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線(xiàn)使激光的強度輸出為最大。

　　液流速度：可通過(guò)操作臺數字顯示監督，調節　氣體壓力大小以獲得穩定的液流速度。

　　測量區光路調節?。哼@是調試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區的液流、激光束、90散射測量光電系統垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。

　　流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統進(jìn)行校準或標定，這樣才能通過(guò)相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標準樣品應該穩定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學(xué)標準樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標準樣品。微球用樹(shù)脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過(guò)程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　　儀器的操作和使用

　?、俅蜷_(kāi)電源，對系統進(jìn)行預熱；

　?、诖蜷_(kāi)氣體閾，調節　壓力，獲得適宜的液流速度；開(kāi)啟光源冷卻系統；

　?、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統；

　?、芾眯蕵藴蕵悠?，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度最強，并要求變異系數為最??；

　?、葸x定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時(shí)選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀(guān)掌握測量進(jìn)程；

　?、迾悠窚y量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統；

　?、咭驗閷?shí)驗數據已存入計算機硬盤(pán)（有的機器還備有光盤(pán)系統，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進(jìn)行數據處理；

　?、鄬⑺杞Y果打印出來(lái)。

　　操作和使用中的注意事項：

　　1）光電倍增管要求穩定的工作條件，暴露的較強的光線(xiàn)下以后，需要較長(cháng)時(shí)間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2）光源不得在短時(shí)間內（一般要1h左右）關(guān)上又打開(kāi)；使用光源必須預熱并注意冷卻系統工作是否正常；

　　3）液流系統必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒；

　　4）注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類(lèi)型等；

　　5）特別強調每次測量都需要對照組。