核酸純化試劑是我們實(shí)驗室常用的實(shí)驗,常說(shuō)的核酸純化是指分離核酸物質(zhì)DNA/RNA和蛋白質(zhì)、多酚、多糖等其他高分子物質(zhì),那么,下面一起了解下核酸純化試劑使用方法和注意事項吧!
01、保持核酸分子一級結構的完整性
02、盡量排除其他分子的污染,保證核酸樣品的純度
細胞分裂
1、物理作用:低滲透分解、超聲波分解、凍融分解、研磨、勻漿等。 用玻璃珠、超聲波、研磨等方法破碎細胞;
2、化學(xué)作用: CTAB法、SDS處理等;
烷基三甲基溴銨是陰離子清除劑,溶解細胞膜,與核酸形成復合體。 該復合體可溶于高鹽溶液,可用有機溶劑提取,去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后,加入乙醇沉淀,從而分離核酸。
堿分解法是質(zhì)粒DNA的常用提取方法。 染色體DNA遠大于質(zhì)粒DNA分子,染色體DNA為線(xiàn)狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)鍵環(huán)狀分子。 用堿處理DNA溶液時(shí),線(xiàn)狀染色體DNA容易變性。 共價(jià)鍵環(huán)狀質(zhì)粒DNA恢復中性PH后恢復天然構象,變性染色體DNA的片段與變性蛋白質(zhì)和細胞片段結合沉淀,成為具有復性的超螺旋質(zhì)粒DNA
3、酶作用:加入溶菌酶和蛋白酶等
在純化具有細胞壁的微生物樣本時(shí),加入溶菌酶等溶解細胞壁,進(jìn)行以下分離和純化。 蛋白酶k是從白色中分離出來(lái)的強力蛋白溶解酶,用于清除核酸酶和其他蛋白污染。
分離和純化
1、加入濃鹽溶液:鹽濃度不同的溶液中,DNA、RNA的溶解度不同
2、加入SDS :將核酸從蛋白質(zhì)上游分離出來(lái)
3、萃?。菏杷缘鞍自谟袡C相中,核酸殘留在上層水相中
4、硅膠吸附:硅膠膜吸附核酸
5、磁珠吸附:利用磁珠選擇性吸附核酸
分離方法的優(yōu)缺點(diǎn):
1、RNA回收效率高、耗時(shí)長(cháng)、不利于自動(dòng)化,也不利于基因組DNA污染
2、鹽析法:產(chǎn)量低,不適合自動(dòng)提取
3、硅膠吸附法:純度高、簡(jiǎn)單方便、無(wú)毒性、可自動(dòng)化
4、磁珠吸附法:產(chǎn)量高、純度好,可以實(shí)驗特異種的核酸分離,可以自動(dòng)化
5、加熱煮沸法:只用于純化DNA,成本低、純度低、產(chǎn)量低
清洗和溶解
清洗:進(jìn)一步除去雜質(zhì),通常使用75%乙醇
溶解:一般使用無(wú)核酸酶水或TE緩沖液