怎樣驗證細胞培養基是否被污染？

　　怎樣驗證細胞培養基是否被污染？

　　細胞培養技術(shù)在生物研究領(lǐng)域內是bi不可少的核心環(huán)節,在培養過(guò)程中面臨的一個(gè)嚴重問(wèn)題就是細胞污染,其中支原體是最主要的污染源。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見(jiàn),而且被支原體污染的細胞培養基在一般情況下往往并不渾濁,細胞受損程度也不明顯,形態(tài)很少改變,因此細胞被支原體污染后很難察覺(jué)。細胞一旦被支原體污染后,支原體會(huì )消耗細胞培養基中的營(yíng)養物質(zhì),代謝產(chǎn)物不斷積累,會(huì )導致細胞培養環(huán)境中pH值的改變,誘導或抑制某些細胞因子的表達,會(huì )影響培養細胞的代謝和增殖特征。

　　在日常工作環(huán)境中,支原體可以說(shuō)無(wú)處不在,它可以通過(guò)人的毛發(fā)、口腔、穿著(zhù)的衣服、動(dòng)物的皮毛以及日常的細胞培養的操作環(huán)境造成對細胞的污染。能夠造成細胞污染的支原體種類(lèi)有很多,有些細胞甚至同時(shí)感染2種以上的支原體。由于支原體體積很小,直徑約在0.2-2.0pm之間,可以通過(guò)濾膜而直接造成培養基或血清的污染。從形態(tài)結構上,支原體形態(tài)多變,多吸附在細胞表面或分散于細胞與細胞之間,是一類(lèi)沒(méi)有細胞壁的微生物,因此對作用于細胞壁類(lèi)的抗生素(如青霉素)不敏感。

　　常用的檢測方法有培養法、熒光染色法、PCR法和電鏡觀(guān)察法。

　　培養法是最為可靠且成本低廉的方法,但培養周期較長(cháng),常用于細胞以及臨床治療細胞的支原體檢査;

　　熒光染色法是用特異熒光染料染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測,熒光染料是一種能和DNA特異結合物質(zhì),如果檢測樣品為支原體污染,則附在細胞表面和分散在細胞與細胞之間的支原體DNA著(zhù)色,在熒光顯微鏡下可見(jiàn);

　　PCR法檢測是通過(guò)對支原體特定的序列設計引物,當存在支原體污染時(shí)通過(guò)PCR特異性擴增,會(huì )將目標DNA特異性的復制,然后通過(guò)瓊脂糖電泳觀(guān)檢測,會(huì )跑出條帶出現陽(yáng)性結果,反之當沒(méi)有支原體污染時(shí),由于沒(méi)有模板,PCR無(wú)法擴增,則瓊脂糖電泳跑不出條帶,出現陰性結果;電鏡觀(guān)察法是利用電子顯微鏡的超級放大功能,直接觀(guān)察培養細胞中支原體污染情況。

　　在此主要介紹利用熒光染色法來(lái)檢測培養細胞中的支原體,具體檢測步驟如下:

　　(1)細胞爬片培養:待測細胞培養至傳代水平,將細胞消化后接種至含有玻片的細胞板中,培養至60%-70%匯合時(shí),進(jìn)行檢測;

　　(2)漂洗:將細胞板中的培養液吸出,取出玻片,用PBS輕輕漂洗;

　　(3)固定:加入適量的固定液,室溫放置10min;

　　(4)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次;

　　(5)染色:加入適量的熒光染料工作液,在室溫下放置10min;

　　(6)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次;

　　(7)鏡下觀(guān)察:將玻片晾干后,滴加抗熒光猝滅劑,于熒光顯微鏡下觀(guān)察、拍照;