蛋白樣品制備詳解—概念篇

 蛋白樣品制備是許多實(shí)驗重要的第一步，蛋白樣品由于其結構特性各異，又必須使其*溶解和盡可能少的化學(xué)修飾，所以不可能有一個(gè)通用的技術(shù)，只能通過(guò)大量的實(shí)驗來(lái)積累經(jīng)驗。正如開(kāi)篇所引用的兩句話(huà)中包含的深意：在研究蛋白的過(guò)程中，既需要嚴謹的技術(shù)流程，規范的操作手段來(lái)確保蛋白研究的完整性，也需要將其看成是*而奇妙的個(gè)體，結合以往經(jīng)驗但又不拘泥于經(jīng)驗，才能真正揭開(kāi)她神秘的面紗。2012年讓我們一起來(lái)回顧一下這一重要技術(shù)及值得關(guān)注的產(chǎn)品。

1.為什么要進(jìn)行樣品制備
“為什么要進(jìn)行樣品制備？電泳的目的不就是分離嗎？"剛接觸雙向電泳的小菜鳥(niǎo)有可能就會(huì )這么問(wèn)。這個(gè)問(wèn)題很好回答，這是由于目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中的蛋白種類(lèi)可達到10萬(wàn)種以上，因此樣品的預分離制備是必須的。另外比如像對臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標記的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的，由于臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類(lèi)細胞，而這類(lèi)細胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細胞等混雜。所以常規采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細胞類(lèi)型，因此需要進(jìn)行有效的樣品制備。

但是為什么要進(jìn)行不同步驟的樣品制備呢？這不僅僅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法來(lái)配合，而且在制備樣品的時(shí)候，首先需要明確的是什么是實(shí)驗的最終目的：是分離盡可能多的蛋白還是分離樣品中某些感興趣的蛋白，這些直接決定了你的制備方法，也決定了實(shí)驗的成功與否。由于想要分離的蛋白必須是*溶解的，溶解的效果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解的過(guò)程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成，因此如果是只對樣品中的一部分蛋白感興趣，可采取預分離的方法，如欲分析的蛋白來(lái)自細胞器（細胞核、線(xiàn)粒體和原生質(zhì)膜），則應先采取超速離心或其他方法將細胞器分離出來(lái)再溶解蛋白；如果是希望分離出盡可能多的蛋白，比如進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，則可以將細胞或組織中的蛋白分成幾部分，分級制備。

2.G Biosciences 小貼士：制備的原則：

1. 應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現性。

2. 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。

3. 防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。

4. *去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。

5. 盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。

以上這五項原則是科學(xué)家們的經(jīng)驗智慧總結，基本上可以說(shuō)是囊括了樣品制備過(guò)程中的抽象注意事項，之后還會(huì )提到具體的注意事項。

3.樣品制備流程

蛋白樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除雜質(zhì)。雖然說(shuō)出來(lái)不過(guò)寥寥的十個(gè)字，但是這幾個(gè)過(guò)程經(jīng)過(guò)這么多年，恐怕還沒(méi)有那位研究人員可以說(shuō)自己已經(jīng)*掌握，面對任何蛋白制備手到擒來(lái)。今天就先簡(jiǎn)單的來(lái)說(shuō)一下破碎這一過(guò)程，其他兩個(gè)步驟方后面詳細說(shuō):

破碎——最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則
樣品制備的第一步當然是細胞或者其它樣品的破碎，這一步看似簡(jiǎn)單，但是操作中一旦方法不當，就有可能會(huì )丟失樣品中的蛋白和導致蛋白被修飾。要想毫發(fā)無(wú)損的通過(guò)這一關(guān)，首先就要分析樣品的來(lái)源，是易碎的細胞還是堅硬的組織？是植物細胞還是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。
破碎的方法有許多種，包括循環(huán)凍融法、滲透法、去污劑法、酶裂解法、超聲波法、高壓法、液氮研磨法、機械勻漿法和玻璃珠破碎法等（可以歸納為機械法、化學(xué)法和物理法），這些方法有不同的應用范圍，基本的原則都是要以最小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破碎這一步的關(guān)鍵所在。抑制蛋白酶降解，減少操作過(guò)程溫度或者其他物理化學(xué)條件對蛋白質(zhì)變性的影響，減少核酸污染對后繼電泳等分析的污染，都是破碎過(guò)程需要考慮的問(wèn)題。

除此之外，為了達到更好的后續抽提效果，G Biosciences發(fā)明了一種用于樣本研磨的小工具，或許可以給你帶來(lái)事半功倍的效果。EZ-Grind是一種分裝到1.5ml的研磨管中的高效的研磨樹(shù)脂，同時(shí)配套有研磨棒。樹(shù)脂用于最適的研磨生物樣本從而來(lái)提取蛋白和DNA，同時(shí)樹(shù)脂是中性摩擦材質(zhì)不會(huì )結合蛋白或核酸。樹(shù)脂，研磨棒，研磨管的配套組合可以高效破壞組織，細胞，細胞核和其他細胞器。它以做到10分鐘內一個(gè)管里可以處理100mg樣本，非常實(shí)用，真正想科學(xué)家之所想。

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