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蛋白樣品制備詳解—酶類(lèi)篇

更新時(shí)間:2021-09-09

閱讀:1538

   當細胞破碎的時(shí)候,蛋白水解酶就會(huì )被釋放出來(lái)或被激活,使電泳結果復雜化,影響最終結果分析。為了避免這些情況的出現,建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外,許多蛋白酶在PH9以上就失活了,因此Tris堿,碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著(zhù)活性,此時(shí)應當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來(lái)說(shuō),選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線(xiàn)設計來(lái)說(shuō)顯得尤為重要。

  蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣,都是紛繁復雜的,通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑,如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類(lèi)蛋白酶起作用,因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑,如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒",見(jiàn)下表(來(lái)自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗技術(shù)》)。

蛋白酶抑制劑

有效抑制的酶

PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常見(jiàn)的抑制劑,使用濃度為1mmol/L 

不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。

AEBSF 絲氨酸抑制劑,使用濃度為4mmol/L 

AEBSF的抑制活性與PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低

EDTA,EGTA,使用濃度為1mmol/L

通過(guò)鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來(lái)抑制金屬蛋白酶。

多肽蛋白酶抑制劑,使用濃度為2-20ug/ml 

亮肽素(Leupeptin)能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶;抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶;抑肽酶(aprotinin)能抑制許多絲氨酸蛋白酶;苯丁抑制劑(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶

TLCk,TPCK,使用濃度為0.1-0.5mmol/L 

不可逆的抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶

芐脒(Benzamidine)使用濃度為1-3mmol/L 

抑制絲氨酸蛋白酶

  但是這樣配置溶液進(jìn)行處理,有時(shí)也是頗為麻煩,而且效果可能并不好,目前有一些廠(chǎng)家試劑在簡(jiǎn)便操作,和抑制效果方面有不俗的表現,可以考慮在實(shí)驗中選用,節約時(shí)間和便于結果分析。

  比如,G-BiosciencesProteaseArrest™蛋白酶抑制劑也許就能滿(mǎn)足這種需要,ProteaseArrest™是一種常規的蛋白酶抑制劑混合物,提供100X濃縮的即用溶液。這種100X濃度的溶液適用于小量,分析樣本的應用。在1ml樣本中加入10微升的ProteaseArrest可以達到大于95%的抑制效率。對于樣本中含量高的蛋白酶的情況,可以適當增加ProteaseArrest的量來(lái)達到更大的抑制效率。

  抑制劑混合物包括針對絲氨酸、半胱氨酸、鈣蛋白酶和金屬蛋白酶可實(shí)現可逆和不可逆的抑制??蛇x擇的EDTA的溶液可實(shí)現增強的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中,它將抑制那些需要二價(jià)陽(yáng)離子(Ca2+, Mg2+ Mn2+)來(lái)起作用的蛋白質(zhì)的活性。除此之外,EDTA會(huì )抑制那些通過(guò)使用固定金屬親和層析色譜純化得到的蛋白,也包括6XHis標簽重組蛋白。

  由于各種抑制劑組分的*化的濃度,ProteaseArrest表現出優(yōu)異的蛋白酶活性的抑制,因而它適合在從動(dòng)物組織,酵母,植物和細菌中進(jìn)行蛋白純化和樣本制備過(guò)程中來(lái)保護蛋白。

  ProteaseArrest也有獨立包裝的小包裝,能夠在10ml的溶液中達到大于95%的抑制效率。這種OneQuant™小包裝主要是為了科研人員方便使用。

  實(shí)重要的是ProteaseArrest也可以根據實(shí)驗的情況來(lái)優(yōu)化蛋白酶抑制劑的濃度,比如組織中含有高于常規量的蛋白酶的時(shí)候,可以加入2X或者更高濃度的ProteaseArrest的量。

在研究中,發(fā)現1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率達到了95%0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物為例)。

 

  除了蛋白酶抑制劑以外,在許多研究過(guò)程中,尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學(xué)機制的時(shí)候,需要了解蛋白磷酸化途徑,因此一個(gè)重要的步驟就是準確的觀(guān)察一般和特異的磷酸化狀態(tài),所以蛋白抽提的另一個(gè)重要保護過(guò)程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護。

  磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶(例如:堿性磷酸酶),特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest™磷酸酶抑制劑混合物,它能夠保持細胞和組織中蛋白的磷酸化狀態(tài)。PhosphataseArrest™包括3種抑制劑產(chǎn)品。

phosphataseArrest™ I

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶抑制劑,能夠特異性的抑制絲氨酸/蘇氨酸,和酪氨酸雙重特異性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一種穩定的溶液組成,含有氟化鈉,正釩酸鈉,焦磷酸鈉,β-磷酸甘油,鉬酸鹽等。

磷酸酶抑制劑

分子量

靶向磷酸酶

氟化鈉

42

酸性磷酸酶

正釩酸鈉

183.9

酪氨酸磷酸酶,堿性磷酸酶

焦磷酸鈉

221.94

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶

β-磷酸甘油

306.1

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶

鉬酸鹽

205.92

酸性磷酸酶

 

PhosphataseArrest™ II

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶的抑制劑能夠抑制酸性,堿性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ II含有優(yōu)化濃度的氟化鈉,酒石酸鈉,正釩酸鈉,咪唑和鉬酸鹽。

磷酸酶抑制劑

分子量

靶向磷酸酶

氟化鈉

42

酸性磷酸酶

正釩酸鈉

183.9

酪氨酸磷酸酶,堿性磷酸酶

酒石酸鈉

230.08

酸性磷酸酶

咪唑

68.08

堿性磷酸酶

鉬酸鹽

205.92

酸性磷酸酶

 

PhosphataseArrest™ III

一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制劑能夠抑制堿性和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ III是一種穩定的,方便的溶液,由斑蝥素,對溴四咪唑草酸鹽腫瘤促進(jìn)劑組成。

磷酸酶抑制劑

分子量

靶向磷酸酶

斑蝥素

196.2

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶

對溴四咪唑草酸鹽

373.23

堿性磷酸酶

腫瘤促進(jìn)劑

1009.17

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶

 

總而言之,在實(shí)驗中適當的選擇一些經(jīng)過(guò)嚴格的質(zhì)量監控的產(chǎn)品,想來(lái)相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復性,和有效性,讓我們在下游應用中得到更潔凈和清晰的結果。

 

華雅思創(chuàng )生物G-Biosciences全國授權代理

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華雅思創(chuàng )生物是為生命科學(xué)領(lǐng)域內的科學(xué)研究、細胞治療和生物制藥相關(guān)人員提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)的生物高科技集團,主辦的干細胞搜網(wǎng)(ys-bio,cn)為中國干細胞領(lǐng)域較大資源庫,網(wǎng)站提供:蛋白質(zhì)組學(xué)研究試劑、干細胞治療產(chǎn)品、細胞培養試劑耗材、臍帶MSC間充質(zhì)干細胞培養基、IPS細胞ES胚胎干細胞培養基、DC細胞淋巴細胞無(wú)血清培養基、R&D細胞因子等種類(lèi)豐富的產(chǎn)品。以“Yes Service"核心服務(wù)理念,緊緊圍繞“Yes Service focus on Biology  專(zhuān)注生物"打造中華民族全新服務(wù)體系,我們與客戶(hù)攜手一起探索生命科學(xué)奧秘,解決人類(lèi)健康問(wèn)題,發(fā)展綠色環(huán)保生態(tài),推動(dòng)世界和諧持續發(fā)展。


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