免疫印跡的化學(xué)發(fā)光底物原理

 當底物發(fā)生化學(xué)反應而產(chǎn)生的能量以光的形式釋放出來(lái)的時(shí)候，我們稱(chēng)這個(gè)過(guò)程為化學(xué)發(fā)光。魯米諾（luminol）是常用的化學(xué)發(fā)光試劑之一，被過(guò)氧化物氧化后它會(huì )產(chǎn)生一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物——aminophthalate。這種產(chǎn)物衰變至低能態(tài)的同時(shí)釋放出光子。添加物可以提高魯米諾反應的發(fā)光強度和持續時(shí)間以及靈敏度。
 化學(xué)發(fā)光底物被廣泛使用是因為其具有其他檢測方法不具備的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得化學(xué)發(fā)光成為大多數蛋白實(shí)驗室檢測方法。使用化學(xué)發(fā)光可以通過(guò)多次曝光獲得成像結果。還可以將檢測試劑*去除，再對其他目的蛋白進(jìn)行檢測并成像，或對檢測條件進(jìn)行優(yōu)化。具有很寬的線(xiàn)性響應范圍，從而可以檢測并定量很寬濃度范圍的蛋白質(zhì)。最重要的是，化學(xué)發(fā)光在所有的檢測方法中具有最高的靈敏度。使用辣根過(guò)氧化物酶標記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT™ PLUS (貨號 # 786-003)，可以檢測的下限為飛克級，而這得益于這種底物中的增強劑可以很大程度地增強發(fā)光強度并提高靈敏度。
 化學(xué)發(fā)光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發(fā)生反應的時(shí)候才會(huì )產(chǎn)生瞬時(shí)的可被檢測的光。這與那些可產(chǎn)生穩定有顏色產(chǎn)物的底物不同；些有顏色的沉淀在酶-底物反應結束之后仍然存在于膜上。在化學(xué)發(fā)光免疫印跡中，底物是反應限制試劑。一旦其耗盡，光就會(huì )逐漸變弱并消失。實(shí)驗中一定要使用適當稀釋濃度的抗體，這樣才會(huì )在幾小時(shí)內產(chǎn)生穩定的光信號輸出，從而維持蛋白檢測的一致性和靈敏度。當抗體沒(méi)被足夠稀釋時(shí)，永遠不會(huì )獲得穩定的光信號輸出。系統中太多的酶會(huì )快速氧化底物并終止信號。

 化學(xué)發(fā)光，魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會(huì )被氧化形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰變至基態(tài)的過(guò)程中會(huì )發(fā)出波長(cháng)為425nm的光。

femtoLUCENT™ PLUS

化學(xué)發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)

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