流式細胞術(shù)檢測的工作原理

今天小編給大家簡(jiǎn)述一下流式細胞儀檢測的工作原理，希望對您的實(shí)驗工作有所幫助！

儀器設備：

在流式細胞術(shù)中使用的儀器稱(chēng)為流式細胞分析儀，通?？s寫(xiě)為“細胞分析儀"。流式細胞分析儀由一個(gè)用于進(jìn)行細胞處理的流體系統和一個(gè)包括數據采集信號檢測器和處理器的光學(xué)系統組成。專(zhuān)為 FACS 設計的儀器還包含一個(gè)細胞分選組件，該組件可將細胞引導到不同的捕獲容器中。

流體系統設計用于生成單細胞的均勻流，以確保當細胞被用于檢測的光源照射時(shí)，能夠進(jìn)行適當分析。這通過(guò)使用加壓管將細胞從樣品管注入流室中來(lái)完成。從容器（通常是一根試管或一塊多孔板）中抽取細胞樣品，并將其注入流動(dòng)液體（稱(chēng)為鞘液）層流中間的流室中。通過(guò)一個(gè)稱(chēng)為流體動(dòng)力學(xué)聚焦的流程，鞘液可幫助縮窄細胞流，從而將細胞組織成一行大致單行的流線(xiàn)。

流式細胞分析儀的光學(xué)系統包括照明源、過(guò)濾器、透鏡和收集光學(xué)器件。照明源常包括 1 個(gè)或多個(gè)激光束，且每個(gè)激光器發(fā)射的光波長(cháng)不同。檢測器不區分各種光波長(cháng)，而是通過(guò)放置在光路徑中的過(guò)濾器來(lái)將光限制在所需波長(cháng)范圍內。

相關(guān)試劑：

   為了通過(guò)流式細胞術(shù)分析特定靶標，對細胞組分進(jìn)行熒光標記。這可以通過(guò)使用單獨的熒光分子（例如，細胞染料）或熒光團標記的抗體（直接偶聯(lián)抗體或使用偶聯(lián)二抗）來(lái)完成。

1.流式細胞術(shù)中抗體的使用

抗體是許多生物檢測中的關(guān)鍵工具，在流式細胞術(shù)中也不例外?？贵w具有特異性結合單個(gè)蛋白或蛋白修飾的能力，并且可作為一種方法來(lái)標記那些用于進(jìn)行檢測的靶標。通過(guò)標記目的靶標，研究人員可以評估各種細胞類(lèi)型、疾病狀態(tài)、治療條件、發(fā)育階段或其他生物模型中蛋白的豐度或活性。與不同蛋白結合的抗體不會(huì )相互干擾，因此，可以使用多種抗體同時(shí)檢測多個(gè)靶標。這稱(chēng)為多重分析?？贵w數量的限制是獨立于其他抗體測定每種抗體的能力。在流式細胞術(shù)中，這種差分測定使用稱(chēng)為熒光團的熒光分子來(lái)完成。成功的實(shí)驗要求具有高度特異性和經(jīng)驗證的抗體以及可靠的熒光團。

2.流式細胞術(shù)中熒光團的使用

熒光團的共同特性是能夠發(fā)射與用于照亮染料的光相比波長(cháng)更長(cháng)的光。例如，如果使用藍色激光器來(lái)照亮稱(chēng)為綠色熒光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白會(huì )吸收藍光并發(fā)射綠光。被吸收的光與被發(fā)射的光之間的波長(cháng)差異稱(chēng)為斯托克斯位移。

就是這種位移讓人們能夠準確定量來(lái)自熒光團的光，因為它能夠過(guò)濾來(lái)自激發(fā)源的光的波長(cháng)。激發(fā)源總是比從正在分析的熒光團中發(fā)射的熒光更亮些，并且如果這種光無(wú)法移除，那么它將會(huì )強烈影響檢測器。

熒光染料吸收的光的范圍稱(chēng)為“激發(fā)"光譜，而激發(fā)時(shí)其發(fā)出的熒光稱(chēng)為“發(fā)射"光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜針對所有常見(jiàn)染料提供，并呈曲線(xiàn)顯示各波長(cháng)下吸收或發(fā)射的光量。

3.偶聯(lián)抗體

通常，在流式細胞術(shù)實(shí)驗中用于獲取讀數的熒光團會(huì )與抗體共價(jià)結合。該過(guò)程稱(chēng)為偶聯(lián)，并且該抗體-熒光團配對稱(chēng)為偶聯(lián)物。當在一項細胞檢測中使用偶聯(lián)抗體時(shí)，熒光團發(fā)射的光可作為細胞內或細胞上存在的抗體量的一個(gè)直接指標。（由于細胞膜是透光的，細胞內熒光團發(fā)射的光不會(huì )顯著(zhù)衰減。）通過(guò)使用特異性結合蛋白或蛋白修飾的偶聯(lián)物，研究人員可以根據每個(gè)細胞發(fā)射的熒光水平，直接量化該細胞中的目的靶標。該過(guò)程稱(chēng)為直接檢測或直接流式細胞術(shù)。

流式細胞術(shù)的直接與間接染色

直接：直接偶聯(lián)抗體

可直接多重分析來(lái)自同一宿主的抗體

由于孵育和洗滌步驟更少，因此實(shí)驗步驟更快

能夠在一項檢測中使用許多不同的抗體，從而能夠同時(shí)讀取大量終點(diǎn)

間接：非偶聯(lián)一抗 + 偶聯(lián)二抗

可改善以低豐度存在的靶標的檢測，同時(shí)由于二次放大可提供更高的靈敏度（多個(gè)二抗結合一個(gè)一抗）

當直接偶聯(lián)物尚未獲得時(shí)，有益于一抗的初始驗證

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