人間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基

   間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基是 為擴增從骨髓、臍帶血或脂肪組織提取的人類(lèi)間充質(zhì)干細胞（human mesenchymalstem cells, hMSC）而設計的無(wú)血清培養基。該人間充質(zhì)干細胞培養基化學(xué)成分明確，所有組分為化學(xué)合成或重組純化的蛋白，并且無(wú)異源蛋白，不含直接從任何動(dòng)物組織提取成份。因此它不存在批間誤差和潛在的動(dòng)物源性病原體。如果配合使用特定的培養板（見(jiàn)下），還可以省去鋪板的工序和時(shí)間，免去鋪板膠的費用。

一 人間充質(zhì)干細胞培養基配制：

1. 2‐8℃解凍添加物。

2. 無(wú)菌條件下配制100ml間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基。

3.如果需要也可加入抗菌素（自選）。

配制好的間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養液（包含基礎培養基、添加物、谷氨酸鹽）2-8℃ 避光保存，保存期1 個(gè)月。

二 培養基的使用：

培養于其它無(wú)血清或有血清培養基的MSCs 可以快捷方便地轉換到本品中培養。多數情況下，生長(cháng)狀態(tài)良好的MSCs直接換液為本品即可。個(gè)別情況下，可能需要逐步轉換，如按20%，40%，60%，80%，100%依次遞增，至zui終*使用本品。

三 StemRD hMSCs細胞的復蘇：

1.37℃水浴快速復蘇凍融細胞。

2.將細胞轉移到無(wú)菌50ml離心管中。

3.逐滴向裝有1ml細胞液的離心管中加入10ml預先復溫的間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基，注意邊加邊輕輕晃動(dòng)離心管。

4.將上述混合溶液轉移到細胞培養瓶或細胞培養板中。

5.在5%CO2，37℃培養箱中靜置培養。

6.培養24h，換液。

7.此后每隔2天換液，直到傳代培養。

四 StemRD人間充質(zhì)干細胞無(wú)血清培養基傳代培養：

如果使用特定的細胞培養板，如BD PrimariaTM 系列產(chǎn)品或Corning CellBINDTM 系列產(chǎn)品，那么使用本產(chǎn)品培養間充質(zhì)干細胞是不需要預先鋪板。傳統的細胞培養瓶和培養板是否無(wú)需鋪板正在評估中。對于那些還沒(méi)有被評估的產(chǎn)品或不適用于不預先鋪板工序的產(chǎn)品，推薦使用人纖維連接蛋白（Fibronectin）進(jìn)行鋪板。

1.在鏡下觀(guān)察（使用本產(chǎn)品或其它培養基）細胞，確定傳代的時(shí)間，推薦在細胞量達到70%滿(mǎn)的時(shí)候傳代，不要讓細胞超過(guò)80%滿(mǎn)！

2.預先將0.05%胰酶/0.53mM EDTA和間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基復溫到37℃待用。

3.用移液槍吸走舊培養基。

4.用DPBS洗一遍（自選）。

5.加入0.05%胰酶/0.53mM EDTA液以覆蓋住細胞表面，推薦室溫消化細胞（消化液用量：6孔板每孔約10cm2加入0.5ml，25cm2培養板加入1ml）。

6. 鏡下觀(guān)察細胞，當看見(jiàn)細胞開(kāi)始從培養板底脫離，輕輕敲擊培養板邊緣幫助細胞脫落。消化時(shí)間為1‐3分鐘。

7. 加入2倍于消化液體積的間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基，將細胞懸液收集于15ml離心管中。

8.1200rpm離心10分鐘。

9.盡量棄去離心后的上層清液。用間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基重懸細胞。此時(shí)可取細胞懸液進(jìn)行細胞計數。

10.按照3-5X103/cm2密度接種細胞。

11.5%CO2，37℃培養箱中培養。

12.每隔2天換新鮮的間充質(zhì)干細胞無(wú)血清*培養基。

13.當細胞生長(cháng)達到70%滿(mǎn)時(shí)，傳代（一般每隔3-4天）。

五 凍存細胞：

1.配制細胞凍存液。

2.離心分離細胞，用凍存液重懸細胞。

3.將凍存管轉移到凍存盒中，置于-80℃冰箱。

4.將細胞轉移到液氮罐中長(cháng)期貯存。