無(wú)血清培養基

培養基（Medium）是供微生物、植物和動(dòng)物組織生長(cháng)和維持用的人工配制的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無(wú)機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養基還含有抗菌素和色素。 
　　無(wú)血清培養基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長(cháng)時(shí)間生長(cháng)繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的*培養基可以滿(mǎn)足大部分細胞培養的要求，但對有些實(shí)驗卻不適合，如觀(guān)察一種生長(cháng)因子對某種細胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(cháng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(cháng)因子；又如需要測定某種細胞在培養過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(cháng)因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養基，可滿(mǎn)足眾多廠(chǎng)商的需求。

和試劑被廣泛的應用于培養哺乳動(dòng)物和無(wú)脊動(dòng)物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數的無(wú)血清產(chǎn)品含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應器剪切力，提供細胞貼壁所需的基質(zhì)，作為脂類(lèi)和其他生長(cháng)因子的載體等。
　　一、的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。 
　　用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養時(shí)，多數呈貼壁生長(cháng)或兼性貼壁生長(cháng)；而當其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養基中生長(cháng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長(cháng)。 
　　添加組分包括以下幾大類(lèi)物質(zhì)： 
　　(1）促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長(cháng)，這種情況下中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著(zhù)重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。 
　　(2）促生長(cháng)因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長(cháng)因子。激素也是刺激細胞生長(cháng)、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞*的，如胰島素。 
　　(3）酶抑制劑：培養貼壁生長(cháng)的細胞，需要用胰酶消化傳代，在中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。zui常用的是大豆胰酶；抑制劑。 
　　(4）結合蛋白和轉運蛋白：常見(jiàn)如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的都含有牛血清白蛋白。 
　　(5)微量元素：硒是zui常見(jiàn)的。 二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細胞培養中zui基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長(cháng)狀況不良時(shí)，常常會(huì )先使用有血清的培養液進(jìn)行培養，待細胞生長(cháng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養液。細胞轉入培養要有一個(gè)適應過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養。在降低過(guò)程中要注意觀(guān)察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長(cháng)期培養于而不發(fā)生改變的。細胞轉入無(wú)血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。 
　　為了使細胞適應無(wú)血清培養，關(guān)鍵的是使所培養細胞： 
　　●處于對數生長(cháng)中期 
　　●>90% 活細胞率 
　　●適應時(shí)以較高的起始細胞接種 
　　有兩種方法使細胞適應（SFM）: 
　　1. 直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到（SFM）中。 
　　一些類(lèi)型細胞可直接從包含血清的培養基適應。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時(shí)，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時(shí)，細胞*適應了。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時(shí)，貯備的適應了的細胞培養物應該再次傳代培養。 
　　2. 連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。 
　　●以2倍正常接種密度接種生長(cháng)活躍的細胞培養物到75%有血清培養基：25％SFM 混合培養基中，傳代培養。 
　　●當細胞密度>5×105細胞/ml時(shí)，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。 
　　●以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75% SFM中傳代培養。 
　　●當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養基中傳代培養。 
　　●每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時(shí)，貯備的適應了的細胞培養物應該再次傳代培養。 
　　建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進(jìn)行幾次傳代。 
　　在適應過(guò)程中，不要讓細胞生長(cháng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。 
　　細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過(guò)下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養基。每次適應改變血清比例時(shí)，傳代細胞2到3次。 
　　培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(cháng)的延遲可能會(huì )發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(cháng)率恢復到以前的水平。 
　　特別需要強調的是：配制無(wú)血清培養液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養能否成功的關(guān)鍵因素之一。 
　　三、使用的優(yōu)點(diǎn) 
　　●增加確定性 
　　●性能更加一致 
　　●容易進(jìn)行純化和下游加工 
　　●細胞功能的評估 
　　●增強生長(cháng)和/或產(chǎn)量 
　　●生理反應性的較好對照 
　　●增強細胞內中介物的檢測