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羊水細胞培養原文鏈接:http://www.stemcell.so/article-1041.html
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干細胞搜網(wǎng)實(shí)驗室人員教您如何做好羊水細胞培養:
羊水中含有胎兒脫落的上皮細胞,可在體外培養用以分析胎兒染色體核型。目前國內 外大都采用腹腔羊膜穿刺術(shù),妊娠12-30周的羊水細胞均可培養成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析,*孕周為16周左右。因此時(shí)羊水增長(cháng)快,羊水中細 胞較多,細胞培養易于生長(cháng),而且不易損傷胎兒。國內多數選擇的穿刺時(shí)間在妊娠的第16-30周。國外現已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺,但需在B超下定位 及穿刺。羊水量按妊娠時(shí)間大致計算(1ml/w)。資料表明,穿刺病例的妊娠結局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無(wú)明顯差異。
1、實(shí)驗材料
2,5%碘酒、75%酒精、無(wú)菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無(wú)菌腰穿針、吸管、培養瓶、培養液(PRMI 1640、199、F10、F12)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養皿、蓋玻片等。
2、培養液配制
F-12 85%
小牛血清 15%
雙抗 100u/ml
小瓶貯藏 4-8℃
3、操作過(guò)程
A(蓋玻片培養法)
?。?)采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無(wú)菌離心管中;(2)收集:離心分離細胞,1000rpm10分鐘,去 上清,留0.5ml,輕打混勻;(3)接種:30mm培養皿中放蓋玻片1張,每片滴混勻的細胞液1-2滴,置培養箱內培養30-60分鐘;(4)培養:取 出后從蓋玻片外加培養液2ml,靜置培養48小時(shí)后觀(guān)察細胞生殖狀況并定時(shí)換液,5-10天后,可見(jiàn)大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長(cháng);(5)終止培養:當 有大量圓形發(fā)亮細胞出現時(shí),加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時(shí);(6)低滲:倒掉培養液,加預溫37℃0.075MKCL溶液 5ml,37℃溫育30分鐘,鏡下可見(jiàn)脹大的羊水細胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液預固定;(7)固定:倒掉低滲液,加5ml固定液固定30分鐘以上,反復3次;(8)干燥:將附有細胞的蓋玻片斜放于培養皿中, 置80℃烤箱處理2-3小時(shí);(9)膠片:將附有細胞的蓋玻片用樹(shù)脂膠封固于玻片上,正面朝外,小心細胞破壞;
B(常規培養法)
?。?)—(2)相同于蓋玻片培養法;(3)接種:將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養瓶?jì)?,平?0ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶 加5-10ml混合培養液。(4)培養:酒精燈火先封口,靜置培養48小時(shí)后觀(guān)察細胞貼臂及生長(cháng)情況,5-10天后可見(jiàn)瓶底面有大量羊水細胞生長(cháng);(5) 終止培養:同A法;(6)細胞收集:將培養液倒入一干凈離心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,輕輕搖動(dòng),使培養瓶底面*接觸消化酶, 然后用彎頭吸管吹打,待細胞全部脫落后加前培養液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘,棄上清,留細胞沉 慮。若一次消化不*,可反復消化;(7)低滲及預固定:加預溫37℃KCL溶液10ml,37℃溫育30分鐘,加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰 乙酸固定液預固定,用氣泡吹打細胞使其混勻。(8)固定:用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分鐘。固定液加入時(shí)沿管壁緩慢加入;(9)制片及干 燥:用絨毛制片;
(10)分帶處理。
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