胰酶消化法培養原代細胞實(shí)驗_干細胞搜網(wǎng)_www.stemcell.so

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實(shí)驗方法原理 

將動(dòng)物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長(cháng)和繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養。因此，較為嚴格地說(shuō)是指成功傳代之前 的培養，此時(shí)的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實(shí)際上，通常把*代至第十代以?xún)鹊呐囵B細胞統稱(chēng)為原代細胞培養。zui常 用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。
 
實(shí)驗材料 

胎鼠新生鼠

試劑、試劑盒 

1640培養基牛血清胰酶Hank’s液碘酒

儀器、耗材 

培養箱 培養瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術(shù)器械 血球計數板 離心機 水浴箱

實(shí)驗步驟 
一、實(shí)驗材料準備

1.  Hank’s液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作

1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(cháng)、以免酒精從口和肛門(mén)浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。
 
2.  用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
 
3.  用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank’s液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。
 
4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
 
5.  加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
 
6.  靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
 
7.  1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
 
8.  加入Hank’s液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
 
9.  加入培養液1-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。
 
10.  將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25 ml細胞培養瓶中，37℃下培養。