WGA技術(shù)如何選擇？

單細胞全基因組測序技術(shù)是在單細胞水平對全基因組進(jìn)行擴增與測序的一項技術(shù)，其原理是對分離的單個(gè)細胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測序，廣泛應用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究。
  獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴增產(chǎn)物是準確全面的測序結果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無(wú)偏好性的擴增，在單細胞測序技術(shù)誕生的近二十年時(shí)間里，全基因組擴增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小編就來(lái)為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據實(shí)驗目的選擇相應的擴增方式。

（Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction）

  技術(shù)原理：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機序列，可以隨機的和基因組DNA結合，從而實(shí)現對全基因組的擴增[1]。

  應用范圍：因為PCR的指數擴增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對染色體的CNV進(jìn)行定量。
 商品化試劑盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit

（Multiple Displacement Amplification）

  技術(shù)原理：2001年由Laskin團隊發(fā)明，使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進(jìn)行反應，該聚合酶具有很強的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復制保真性[2]。
  應用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對SNV的分析，以及構建大片段文庫上有著(zhù)顯著(zhù)優(yōu)勢。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數擴增，因此依然存在PCR反應的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復，因此MDA法不適合進(jìn)行CNV的分析。

  商品化試劑盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 

 (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

  技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團隊發(fā)明，擬線(xiàn)性的擴增過(guò)程降低了指數擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結合，經(jīng)過(guò)8~12個(gè)循環(huán)的擬線(xiàn)性擴增后，再對這些環(huán)狀的擴增子進(jìn)行指數擴增[3]。
  應用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復的，因此可以通過(guò)對參考細胞標準化后，進(jìn)行CNV的分析；另外，由于其擴增的均一性，MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測SNV時(shí)將會(huì )出現更多的假陽(yáng)性；另外，由于它可重復性的序列偏好性，基因組上低擴增的區域有時(shí)會(huì )在擴增過(guò)程中丟失。

  商品化試劑盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit.