蛋白樣品制備詳解—蛋白質(zhì)保護篇

  蛋白質(zhì)是成分高度復雜的，復雜的生物大分子包括1個(gè)或多個(gè)長(cháng)鏈氨基酸. 蛋白或肽折疊形成二級和三級結構， 和其他蛋白亞基相互作用來(lái)形成四級結構。蛋白是在結構上彼此不同的同時(shí)出于穩定性和活性的目的要求不同的周邊環(huán)境. 蛋白當脫離他們天然的環(huán)境后是非常容易降解，變性和沉淀的。

  在蛋白抽提過(guò)程中，細胞和細胞器膜是被破壞掉從而釋放蛋白到溶液中使蛋白高度不穩定. 蛋白是暴露在溶液中不同的PH值，離子強度，溫度和蛋白酶中. 盡管所有的蛋白是不同的他們要求不同的參數比如穩定性，溶解性和活性, 然而一些因素如果處理好的話(huà)可以保證活性蛋白的抽提，能夠在蛋白抽提過(guò)程中保護蛋白的組分或者因素如下:

緩沖液組分: 在蛋白抽提過(guò)程中為蛋白提供適宜的緩沖液環(huán)境是非常重要的，這樣蛋白可以應付突然變化的PH值。如果蛋白抽提裂解緩沖液不是蛋白適宜的緩沖液蛋白會(huì )很容易發(fā)生不可逆的變性。

一個(gè)好的蛋白抽提緩沖液必須在要求的PH值下有很強的緩沖能力，水溶性，化學(xué)穩定性，和加到蛋白抽提溶液中的其他添加物的兼容性，以及蛋白下游應用的兼容性。

大部分常規使用的生物緩沖液有 pK_a 大約 7因此可以用于生理PH值下。 常用的生物緩沖液的是磷酸鹽，Tris, MOPS 和HEPES. 這些緩沖液通常使用在 20 mM濃度以上來(lái)保證足夠的緩沖能力.

抽提時(shí)的溫度: 來(lái)自于哺乳動(dòng)物細胞的蛋白適合于他們活性的溫度大約 37 °C以及許多來(lái)自于生長(cháng)在37°C細菌的細菌蛋白也有蛋白穩定性的最適溫度在37°C。鑒于此，我們可以預計成功的蛋白抽提在室溫進(jìn)行。然而溶液中的蛋白在室溫中會(huì )發(fā)生降解因為溶液中蛋白的環(huán)境和細胞中的環(huán)境是不同的。溶液中蛋白沒(méi)有受到如同細胞中伴侶的保護。除此之外蛋白由于存在于溶液中的內源蛋白酶從而容易發(fā)生降解。細胞中的內源蛋白酶在細胞中存在特定的小室中因此不能降解所有的細胞蛋白。蛋白酶的活性在 4°C 時(shí)會(huì )減弱通常來(lái)說(shuō)蛋白的抽提應該在冰上進(jìn)行從而得到活性蛋白。

細胞裂解和蛋白抽提緩沖液的添加劑: 有一些可以添加到蛋白抽提緩沖液中的添加劑，一些是通用的，一些是和需要抽提的蛋白特定的.

鹽: 鹽類(lèi)加入用來(lái)維持蛋白抽提溶液的離子強度. 加入的抽提緩沖液中的鹽的濃度基于蛋白生理環(huán)境下的離子強度。太高或太低濃度的鹽會(huì )導致蛋白的沉淀或變性。絕大多數用于維持蛋白抽提緩沖液中離子強度的常規使用的鹽包括氯化鈉，硫酸銨。

蛋白酶/肽酶: 蛋白酶和肽酶是可以在特定位點(diǎn)切割蛋白從而降解他們。有四種已知蛋白類(lèi)別的蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶， 半胱氨酸蛋白酶, 天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶. 當蛋白而不是蛋白酶需要被抽提可以加入蛋白酶抑制劑來(lái)抑制蛋白的降解。特定蛋白酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物取決于科研人員的需要有商品化的產(chǎn)品。使用蛋白酶抑制劑混合物是不錯的選擇因為人們對于細胞中存在哪些內源蛋白酶的了解是有限的。金屬蛋白酶被金屬螯合劑所抑制比如EDTA 和EGTA. 最常規使用的蛋白酶抑制劑是EDTA, PMSF, 亮肽素和 pepstatin A.

滲透調節物質(zhì): 滲透調節物質(zhì)是影響的滲透的化合物. 滲透調節物質(zhì)可以協(xié)助蛋白的折疊。 他們是作為添加劑來(lái)增強蛋白在溶液中的可溶性和穩定性。在蛋白抽提過(guò)程中最常使用的滲透調節物質(zhì)包括甘油, 去污劑比如 NP40和糖類(lèi)如葡萄糖,蔗糖等.

還原劑: 還原劑可以保護蛋白免受氧化的損害. 當抽提特定性的蛋白時(shí)可以使用還原劑，這些蛋白易于發(fā)生氧化損害。還原劑包括  DTT 等.

華雅思創(chuàng )生物—G-Biosciences全國授權代理

華雅思創(chuàng )生物是為生命科學(xué)領(lǐng)域內的科學(xué)研究、細胞治療和生物制藥相關(guān)人員提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)的生物高科技集團，主辦的干細胞搜網(wǎng)(ys-bio,cn)為中國干細胞領(lǐng)域較大資源庫，網(wǎng)站提供：蛋白質(zhì)組學(xué)研究試劑、干細胞治療產(chǎn)品、細胞培養試劑耗材、臍帶MSC間充質(zhì)干細胞培養基、IPS細胞ES胚胎干細胞培養基、DC細胞淋巴細胞無(wú)血清培養基、R&D細胞因子等種類(lèi)豐富的產(chǎn)品。以“Yes Service"核心服務(wù)理念，緊緊圍繞“Yes Service focus on Biology  專(zhuān)注生物"打造中華民族全新服務(wù)體系，我們與客戶(hù)攜手一起探索生命科學(xué)奧秘，解決人類(lèi)健康問(wèn)題，發(fā)展綠色環(huán)保生態(tài)，推動(dòng)世界和諧持續發(fā)展。